设计引物网页（设计引物的方法步骤ncbi）

摘要： 怎样设计qPCR引物(NCBI网页设计)1、优先选择“transcript variant 1， mRNA”（若无则依次尝试variant 3等），确保使用mRNA序列以排除内含...

怎样设计qPCR引物(NCBI网页设计)

1、优先选择“transcript variant 1， mRNA”（若无则依次尝试variant 3等），确保使用mRNA序列以排除内含子干扰。点击搜索结果中的“FASTA”格式，复制或记录完整的mRNA序列。进入Primer-BLAST工具在NCBI首页搜索“NCBI BLAST”，点击进入工具页面。

2、选择未被验证的引物：在PrimerBank的搜索结果中，找到未被验证的引物对（如primer pair 1-3）。考虑基因组DNA污染的可能性：如果在RNA提取或逆转录过程中已经用DNA酶去除了基因组DNA污染，可以选择primer pair 1-3中的任意一对。如果存在基因组DNA污染且未用DNA酶去除，建议选择跨内含子的引物。

3、点击mRNA编号：在搜索结果中，点击与人的β-actin基因相关的NM开头的mRNA编号。查看mRNA信息：进入mRNA的详细信息页面，这里包含了基因的基本信息、序列等。设计QPCR引物 定位CDS区：在mRNA信息页面中，找到CDS（Coding Sequence，编码序列）区，这是设计QPCR引物的首选区域。

4、选择合适的引物对：在生成的引物对中，根据实验需求选择合适的引物对。考虑到逆转录的方向是3-5，为了规避逆转录可能偶然终止的风险，尽量选取靠近3段的引物。

5、Primer-BLAST介绍 Primer-BLAST是一个在线工具，用于设计聚合酶链反应（PCR）的特异性寡核苷酸引物。它整合了Primer3软件和NCBI的Blast功能，能够直接设计引物并进行特异性验证。Primer-BLAST的链接为：http：//。

6、在NCBI首页，选择“Gene”数据库。输入基因名称：在搜索框中输入TP53的Gene Symbol（即TP53），而不是其常用名“p53”，以确保快速准确地检索到目标基因。引物设计 进入基因详情页面：点击搜索结果中的“TP53-tumor protein p53”，进入该基因的详情页面。

【实用讲解】NCBI使用教程:QPCR引物设计

1、使用NCBI进行QPCR引物设计的步骤如下：选择工具：使用PrimerBLAST在线工具进行引物设计。PrimerBLAST整合了Primer3软件和NCBI的Blast功能，能设计出特异性寡核苷酸引物并验证其特异性。

2、输入完参数后，点击“Get primers”按钮，系统将开始运行并生成若干对引物。运行时间大约需要几十秒。在选择引物时，应注意以下几点：GC百分比：尽量挑选GC百分比在45%-55%之间的引物序列，以确保引物的稳定性和扩增效率。

3、进行引物设计前，需查找序列并打开Primer-BLAST。有两种方法：一是通过NCBI主页的Blast功能找到目的基因mRNA页面，点击右侧工具栏内的Pick Primers。二是复制目的序列后，在NCBI主页直接使用Primer-BLAST。在Primer-BLAST中输入相关参数。通常无需勾选intron inclusion，以免导致DNA污染。

4、获取目标基因的Gene ID 访问NCBI网站：打开浏览器，输入“Home - Gene - NCBI”进入NCBI的基因数据库页面（图一）。检索目标基因：在搜索框中输入“Must musculus Gapdh”（以小鼠GAPDH基因为例），点击搜索按钮。在搜索结果中找到目标基因，并记录下其Gene ID。

5、NCBI作为科研者的重要工具，其内置的Primer designing tool（或Primer-BLAST）功能强大，特别适用于设计特异性的荧光定量PCR引物。以下是使用该工具设计qPCR引物的步骤概要：首先，访问NCBI找到目标基因的序列页面，然后点击Pick Primers跳转到引物设计工具。

想轻松、准确、快速设计好引物,你还差这几步!

第一步：获取基因序列 访问NCBI网站：打开浏览器，输入NCBI网址：https：//。搜索目标基因：在搜索栏选择“Gene”，输入你感兴趣的基因名称，例如“TP53”，然后点击“Search”。选择目标物种和基因：在搜索结果中，选择正确的物种（如人），然后点击目标基因（如TP53）进入详细页面。

首先，获取所需的基因序列至关重要。以人基因TP53为例，在NCBI网站的搜索栏中输入“Gene”，输入“TP53”并点击“Search”。进入页面后，选择人作为物种，点击基因TP53，然后在基因组区域中选择“FASTA”格式文件。接着，点击右侧的引物设计功能。接下来，进入设计引物阶段。

如果对搜索到的引物不满意，可以手动调整引物的位置，并修改引物序列。导出或复制引物：最后将设计好的引物导出或复制出来，用于后续实验。

在引物的适当位置插入之前选择好的酶切位点序列。如果需要，还可以添加保护碱基以提高酶切的效率和准确性。确保引物的方向是5-3，这是DNA合成的标准方向。验证引物设计 完成引物设计后，你可以通过软件提供的模拟切割功能来验证引物的有效性。这将帮助你确保引物能够正确地识别并切割目的基因和质粒。

NCBI设计引物详细步骤

在PrimerBank的搜索结果中，找到未被验证的引物对（如primer pair 1-3）。考虑基因组DNA污染的可能性：如果在RNA提取或逆转录过程中已经用DNA酶去除了基因组DNA污染，可以选择primer pair 1-3中的任意一对。如果存在基因组DNA污染且未用DNA酶去除，建议选择跨内含子的引物。

优先选择“transcript variant 1， mRNA”（若无则依次尝试variant 3等），确保使用mRNA序列以排除内含子干扰。点击搜索结果中的“FASTA”格式，复制或记录完整的mRNA序列。进入Primer-BLAST工具在NCBI首页搜索“NCBI BLAST”，点击进入工具页面。下拉页面，选择“Primer-BLAST”工具入口。

NCBI设计引物的详细步骤：明确目标序列 首先，需要明确你要扩增的目标基因或DNA序列。这通常包括基因的ID（如Genbank ID）或已知的序列信息。

将设计好的引物填入Primer-BLAST界面，分别复制上游引物和下游引物。点击“Primer BLAST”，查看引物可能会与数据库中的多少mRNA序列互补，从而评估引物的特异性。二聚体检测：访问IDT引物分析网站进行引物二聚体检测。在“SELF-DIMER”部分输入正向引物，检查其是否容易形成自身二聚体。

NCBI BLAST引物设计流程主要包括粘贴序列、参数设置和结果验证三个步骤。以下是详细的流程说明：粘贴序列 访问NCBI Primer-BLAST工具：输入网址：https：//？ 进入“Primers for target on one template”引物设计界面。